大鼠DNA甲基化转移酶(DNMT)ELISA试剂盒的实验使用说明书通常包含以下内容,但请注意,具体说明可能因不同制造商和试剂盒版本而有所差异。以下是一个基于通用标准的概述:
BS-8543 大鼠DNA甲基化转移酶(DNMT)ELISA试剂盒
一、产品概述
用途:本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中DNA甲基化转移酶(DNMT)的含量,仅供研究使用。
二、实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠DNA甲基化转移酶(DNMT)水平。用纯化的大鼠DNA甲基化转移酶(DNMT)捕获抗体包被微孔板,制成固相抗体。往包被的微孔中依次加入大鼠DNA甲基化转移酶(DNMT),再与HRP标记的检测抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠DNA甲基化转移酶(DNMT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠DNA甲基化转移酶(DNMT)含量。
三、试剂盒组成
试剂盒通常包含酶标包被板、标准品、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、浓缩洗涤液等组件,具体数量和配置可能因试剂盒规格(如48孔或96孔)而异。
四、样本采集与处理
血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。
组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS(PH7.4)。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。
标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
五、实验步骤
标准品的加样:设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品。
加样:在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液,然后再加待测样品。加样时将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
加酶:每孔加入酶标试剂(空白孔除外)。
温育:用封板膜封板后置37℃温育一定时间。
配液:将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释后备用。
洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置后弃去,重复多次,拍干。
显色:每孔加入显色剂A和B,轻轻震荡混匀,37℃避光显色。
终止:每孔加终止液,终止反应。
测定:以空白孔调零,在450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
六、注意事项
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡一段时间后方可使用。
浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性。
封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
底物应避光保存。
严格按照说明书的操作进行,试验结果判定以酶标仪读数为准。
七、性能与保存
性能:样品线性回归与预期浓度相关系数R值通常0.95,批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15%。
保存:试剂盒应保存在2-8℃,有效期通常为6个月。
请注意,以上信息为通用标准概述,具体实验时应严格遵循所使用试剂盒的说明书进行操作。